本期将探讨：

什么是 FLIM？

关联式 FLIM 与拉曼成像

植物组织切片和 HeLa 细胞的 FLIM-拉曼成像应用示例

背景

拉曼光谱能够以显微级分辨率揭示结构和生物化学的细微变化。对于生物样品而言，拉曼分析具有无标记、无损检测的显著优势，因此非常适合与其他基于显微镜的成像技术相集成。对于从事生物学研究和医学诊断的科学家来说，将荧光寿命显微成像 (FLIM) 与拉曼光谱联用是一种明智且有价值的选择。

01、什么是拉曼光谱分析？

图1展示了拉曼光谱的获取过程：首先，将激发激光聚焦在样品上（例如组织切片）。少量光子会与样品中的分子振动发生能量交换，从而产生拉曼散射。拉曼散射光的能量和颜色随之发生变化。为了记录拉曼光谱，需通过衍射光栅将拉曼散射光色散至 CCD 探测器。所得光谱由一系列拉曼谱带组成，这些谱带对应于样品内部的分子振动模式。因此，拉曼光谱能够提供关于材料中原子及化学键的重要信息。

当今科研级显微拉曼光谱仪具备快速拉曼成像能力。通过在样品不同位置采集拉曼光谱，可以生成显示化学成分分布或结构变化的图像，且具有高度特异性。

02、什么是FLIM？

当光与荧光基团相互作用后，该基团会进入电子激发态，并在返回基态时发射光子。荧光寿命是指荧光基团在返回到基态之前，保持电子激发态的特征时间。如果我们采集样品不同位置的荧光寿命，并将其空间分布及变化情况生成图像，这种技术称为荧光寿命显微成像 (FLIM)。

FLIM 在生命科学领域发挥着重要作用，可用于分析包括微生物、细胞和组织在内的生物样品。荧光衰减的寿命对分子环境和由此产生的分子构象变化很敏感。生物学家利用 FLIM 研究多种性质，包括：

•pH 值/离子浓度/氧气浓度

•分子键合

•能量供体与受体的相对距离，例如通过 FLIM-FRET（福斯特共振能量转移）技术研究蛋白质相互作用

FLIM 尤其适用于细胞生物学研究，包括分子相互作用监测、癌症诊断、活细胞成像、荧光基团识别以及环境传感等领域。

要进行FLIM测量，需要在共焦显微镜上配置脉冲激光器。脉冲激光用于照射含有荧光基团的样品，探测器则通过时间相关单光子计数 (TCSPC) 技术记录发射的荧光信号。 TCSPC FLIM 技术测量入射光到达样品与荧光到达探测器之间的时间差。常用的探测器类型是单光子雪崩二极管 (SPAD)，其时间分辨率可达到皮秒级。图2为典型 TCSPC FLIM 系统的示意图。

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探测器记录的荧光衰减动力学数据通常以直方图形式呈现，随后可使用商业 FLIM 软件进行分析。软件会将荧光衰减曲线拟合到数学模型，例如单指数或多指数函数（图3）。

最终，计算得到的荧光寿命值会以 FLIM 图像的形式显示（图4）。FLIM 图像的对比度源于样品内部分子相互作用的差异，可帮助生物学家直观观察样品中具有不同蛋白质相互作用或构象状态的区域。

FLIM-拉曼成像联用

FLIM 与显微拉曼光谱技术均属于无标记、非侵入性、无损的分析方法，二者联用可深入解析与分子相互作用相关的化学变化。两种技术在优势和信息获取方面高度互补，具体总结见下表。

FLIM 与拉曼光谱技术均基于显微镜，并采用激光对样品进行探测，因此，关联式 FLIM-拉曼成像可集成于同一显微镜系统（图5）。雷尼绍 inVia™ 共焦显微拉曼光谱仪即可作为联用系统的基础。雷尼绍与 Becker & Hickl 公司合作，在系统中集成了 405 nm 脉冲激光器（脉冲宽度 < 40 ps）、SPAD 探测器（时间分辨率 < 40 ps）以及其他先进的精密计时电子设备。

案例分享

在样品的多个点上执行 TCSPC FLIM 成像，以获取 FLIM 图像。拉曼成像与 FLIM 成像均使用同一XY 样品台，这使得系统能够基于相同的测量坐标，直接实现多模态数据的像元级关联。因此，FLIM 图像与拉曼图像可以直接叠加，无需额外进行图像关联。在下面示例中，均采用集成 FLIM 模块的 inVia 显微拉曼光谱仪进行测量，其中，木材细胞的拉曼成像使用 785 nm 激发激光，而哺乳动物细胞的拉曼成像则使用 532 nm 激发激光。

示例1：植物生物学

FLIM 是一种高效的无标记成像技术，能够利用植物样品的天然自发荧光特性开展相关研究。我们利用关联式 FLIM 和拉曼技术研究了树脂分泌细胞在化学结构或代谢活性方面是否与其他木材细胞有所不同。FLIM 提供了有关树脂分泌通道附近木材细胞代谢活性的关键信息，拉曼成像则识别出与树脂和木质素相对应的化学成分。

木材由高度有序排列的细胞构成，这种结构不仅赋予木材卓越的机械强度和耐久性，还能实现树木体内营养物质的运输。木材细胞壁的主要成分是芳香族聚合物 — 木质素，它通过交联作用形成坚固的结构，使木材具备刚性。由于木质素本身具有自发荧光特性，因此木材非常适合采用无标记的 FLIM技术进行研究。此外，木材中还存在树脂通道，这些通道在结构损伤后的修复过程中发挥关键作用。通道内壁由特化细胞构成，它们会向通道内分泌树脂，以完成修复功能。

图6展示了树脂通道及其周围细胞的关联式FLIM-拉曼成像结果。图 6(a) 中的 FLIM 图像显示每个像元的平均荧光寿命。通道内的树脂具有较长的平均荧光寿命（红色），而周围细胞则表现出较短的寿命（蓝色）。位于树脂通道边缘的细胞呈现出中等水平的平均寿命（绿色）。树脂通道边缘细胞与更远处细胞之间的平均荧光寿命差异，可能与细胞活性差异相关。由于边缘细胞主动分泌树脂，它们很可能具有更高的代谢活性。

图 6(b) 中的拉曼图像显示了树脂和木质素的化学成分分布。图 6(c) 中，树脂光谱在 1441 cm⁻¹ 处出现强峰，对应其高脂肪酸含量1；木质素光谱在 1600 cm⁻¹ 和 1656 cm⁻¹ 处呈现特征峰，分别对应其化学结构中的芳香环变形模式，以及松柏醇/松柏醛等结构成分1。拉曼图像显示所有细胞均呈现一致的木质素信号，而在通道边缘细胞中未检测到树脂信号。这表明所有细胞具有相同的化学结构，并进一步确认，通道边缘细胞呈现的中间水平荧光寿命与细胞内树脂的存在与否无关。

通过 FLIM-拉曼联用分析，可实现对木材细胞化学组成与代谢活性的同步研究。关联式 FLIM-拉曼数据表明，树脂分泌细胞与其他木材细胞在化学结构上相同，但在微环境或代谢活性方面存在差异。

示例2：细胞生物学

拉曼光谱与 FLIM 是细胞分析中互为补充的技术。细胞是复杂且动态的系统，化学结构与分子间相互作用的关系是维持细胞健康的基础。理解这种关系不仅有助于区分健康细胞与病变细胞，还能实现疾病状态的识别与监测。图7展示了一个分布着大量 HeLa 细胞的大面积样品的FLIM图像；这是一种快速评估细胞群体中健康异质性的方法。

图8展示了一个无标记 HeLa 细胞的关联式 FLIM-显微拉曼光谱分析结果。拉曼图像提供了详细且高度特异的化学信息，使细胞各区域得以清晰界定，包括细胞核（蓝色）、细胞质（红色）和细胞膜（绿色）；此外，还检测到一个核周结构（黄色），该结构可能包含细胞器，如内质网或高尔基体。

图8(b) 中的 FLIM 图像显示，细胞中央（细胞核外侧区域）的平均荧光寿命较长，而在靠近细胞外围的区域，该寿命明显缩短。这一现象与细胞中央结合蛋白（如 NADH）比例较高的特征一致，提示该区域代谢活性更强。细胞器主要聚集于细胞中央区域，靠近细胞核，这也解释了为什么这些区域呈现更强的代谢活性。 

关联式 FLIM-拉曼分析结果表明，这些细胞器代谢活跃，提示细胞整体健康状况良好。该联用分析方法为细胞整体化学特征及其亚细胞成分研究提供了背景信息和解释框架。

通过将 FLIM 成像模块集成至共焦显微拉曼光谱仪，我们能够在同一样品区域实现拉曼光谱与荧光寿命数据的直接关联。两种技术协同应用，可在高空间分辨率下提供关于化学结构和分子相互作用的互补性信息。我们预计该联用技术将成为生物成像领域的重要工具，并期待未来基于这一技术组合的创新研究。